Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств
изопропилфенацина в воде
методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.2292-07

1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (Т.В. Юдина, Н.Е. Федорова, В.Н. Волкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 21.06.2007 № 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 10 октября 2007 г.

4. Введены в действие с 25 декабря 2007 г.

5. Введены впервые.

Содержание

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
Г.Г. Онищенко

10 октября 2007 г.

Дата введения: 25 декабря 2007 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств изопропилфенацина в воде
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в воде массовой концентрации изопропилфенацина в диапазоне 0,0002-0,004 мг/дм³.

2-(α-фенил-изопропилфенил)-ацетил)-индан-1,3-дион (IUРАС)
С₃Н₇

С₂₆Н₂₂О₃

Мол. масса 382,15

Твердое вещество желто-оранжевого цвета. Температура плавления 148°С, кипения - более 350°С. Плотность 1,21 г/см³. Хорошо растворим в большинстве органических растворителей (ацетоне, этаноле, диэтиловом эфире и др.). Практически не растворим в воде - 0,3 мг/дм³.

Агрегатное состояние в воздушной среде - аэрозоль и пары.

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 1,6±0,2 мг/кг, мышей - 3,4±0,5 мг/кг.

Область применения

Изопропилфенацин - ротентицид класса индандионов, обладающий антикоагулянтной активностью, рекомендуется для борьбы с грызунами в открытом грунте (осень, зима, весна) на зимующих культурах (зерновые, пастбищные травы, древесные, кустарниковые насаждения и др.), в защищенном грунте на всех культурах независимо от сезона. Применяется в виде приманки.

ОДУ изопропилфенацина в воде водоемов - 0,0008 мг/дм³.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и её составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Анализируемый объект	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (дм3)	Показатель точности (граница относительной погрешности) ±δ, %Р=0,95	Стандартное отклонение повторяемости, σr %	Предел повторяемости, r, %	Предел воспроизводимости, R, %
Вода	от 0,004 до 0,001 вкл.	100	4,2	12	15
	менее 0,001 до 0,0002	150	5,4	15	19

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n=20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р=0,95, n=20
	предел обнаружения, мг/дм3	диапазон определяемых концентраций, мг/дм3	среднее значение определения, %	стандартное отклонение, S, %	доверительный интервал среднего результата, ±, %
Вода	0,0002	0,0002-0,004	91,3	3,8	2,7

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемой пробы воды дихлорметаном и последующей очистки экстракта на патроне для твердофазной экстракции Sep Pak Silica.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны (фирмы Waters, США) 15311-02	Номер в Государственном реестре средств измерений
Весы аналитические ВЛА-200	ГОСТ 24104
Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2	ГОСТ 1770
Меры массы	ГОСТ 7328
Пипетки градуированные 2 класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3	ГОСТ 29227
Пробирки градуированные вместимостью 5 или 10 см5	ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 2 класса точности вместимостью 10, 50, 100 и 1000 см3	ГОСТ 1770

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Изопропилфенацин, аналитический стандарт с содержанием основного вещества (сумма изомеров) 94,6% (ЗАО «Щелково Агрохим»)
Ацетонитрил для хроматографии, хч	ТУ 6-09-4326-76
Вода бидистиллированная, деионизованная или перегнанная над КМnО4	ГОСТ 6709
н-Гексан, хч	ТУ 6-09-33-75
Натрий серно-кислый безводный, хч	ГОСТ 4166
Кислота орто-фосфорная, хч, 85%	ГОСТ 6552
Метилен хлористый (дихлорметан), хч	ГОСТ 12794
Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) эталонный	ГОСТ 4166

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)
Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)
Бумажные фильтры «красная лента», обеззоленные	ТУ 6-09-2678-77
Воронки делительные вместимостью 1000 см3	ГОСТ 25336
Воронки конусные диаметром 30-37 и 60 мм	ГОСТ 25336
Груша резиновая
Колбы плоскодонные вместимостью 200-250 см3	ГОСТ 9737
Колбы круглодонные на шлифе, вместимостью 10, 100 и 250 см3	ГОСТ 9737
Мембранные фильтры капроновые, диаметром 47 мм
Насос водоструйный	ГОСТ 10696
Патроны для твердофазной экстракции типа Sep-Pak Plus Silica Cartridges (масса сорбента 690 г)
Пробирки центрифужные	ГОСТ 25336
Ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария	ТУ 25-11-917-74
Стаканы химические, вместимостью 50 и 100 см3	ГОСТ 25336
Стекловата
Стеклянные палочки
Установка для перегонки растворителей через мембрану
Хроматографическая колонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry® С18, зернением 5 мкм
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50-100 мм3
Шприц медицинский с разъемом Льюера	ГОСТ 22090

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20±5)°С и относительной влажности не более 80%.

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов для градуировки и внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка патронов для твердофазной экстракции, проверка хроматографического поведения вещества на них, отбор проб.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5% водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.1.3. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 890 см³ ацетонитрила, 110 см³ бидистиллированной или деионизованной воды и 1 см³ ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.3. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 1,0 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения

7.4.1. Исходный раствор изопропилфенацина для градуировки (концентрация 100 мкг/см³)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,01 г изопропилфенацина, добавляют 50-70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Растворы № 1-5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.4.2. Раствор № 1 изопропилфенацина для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора изопропилфенацина с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.4.1), разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом «внесено-найдено».

7.4.3. Рабочие растворы № 2-5 изопропилфенацина для градуировки (концентрация 0,05-1,0 мкг/см³)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 0,5; 1,0; 5,0 и 10,0 см³ градуировочного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы №№ 2-5 с концентрацией изопропилфенацина 0,05; 0,1; 0,5 и 1,0 мкг/см³, соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике в течение недели.

7.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость суммы площадей 2 пиков орто- и параизомеров изопропилфенацина (мкВ·с) от концентрации вещества в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки №№ 2-5.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 7.5.1. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков изомеров действующего вещества, рассчитывают сумму площадей орто- и параизомеров изопропилфенацина.

Градуировочный график проверяют ежедневно по анализу 2 растворов для градуировки различной концентрации. Если значения площадей отличаются более чем на 10% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

7.6. Приготовление 2% раствора уксусной кислоты в этилацетате

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 50-70 см³ этилацетата, вносят 2 см ледяной уксусной кислоты, доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают.

7.7. Подготовка концентрирующего патрона Sep-Pak Plus Silica для очистки экстракта

Патрон Sep-Pak Plus Silica устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом Льюера объемом не менее 10 см³, используемый в качестве емкости для элюента.

Концентрирующий патрон промывают последовательно 5 см³ этилацетата, затем 5 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему). Процедуру проводят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин, при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

Примечание: В отсутствии специального аллонжа, жидкость продавливают через патрон с помощью шприца, скорость продавливания раствора не должна превышать 1-2 капли в сек.

7.8. Проверка хроматографического поведения изопропилфенацина на концентрирующем
патроне Sep-Pak Plus Silica

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,2 см³ градуировочного раствора №1 изопропилфенацина (п. 7.4.2), растворитель упаривают досуха при температуре не выше 35°С, остаток растворяют в 2 см³ этилацетата, помещают на 30 с в ультразвуковую баню. Затем в колбу добавляют 2 см³ гексана, смесь тщательно перемешивают и вносят на концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.7. Колбу обмывают 5 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) и также вносят на патрон. Патрон дополнительно промывают 15 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), 20 см³ смеси этих же растворителей в объемном соотношении 3:7, затем 20 см³ этилацетата. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1-2 капли в сек. Элюат отбрасывают.

Изопропилфенацин элюируют с патрона 25 см³ 2% уксусной кислоты в этилацетате (п. 7.6), собирая 5 порций элюата по 5 см³ каждая непосредственно в круглодонные колбы. Растворы в колбах упаривают досуха при температуре не выше 35°С. Остаток в каждой колбе растворяют в 2 см³ подвижной фазы (приготовленной по п. 7.2) и анализируют содержание изопропилфенацина по п. 9.3. Фракции, содержащие изопропилфенацин, объединяют и вновь анализируют. Рассчитывают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения изопропилфенацина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб», «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79).

Пробы воды анализируют в день отбора, при необходимости хранят в холодильнике при температуре 4-6°С в течение 10 недель. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре -18°С.

Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

Образец анализируемой воды объемом 500 см³ помещают в делительную воронку, вместимостью 1000 см³, добавляют 75 см³ хлористого метилена, интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой переносят в круглодонную колбу, вместимостью 250 см³, фильтруя его через 2 см слой безводного сульфата натрия, помещенный в конусную химическую воронку диаметром 60 мм, снабженную бумажным фильтром «красная лента». Операцию экстракции водной фазы повторяют, еще дважды порциями этилацетата по 50 см³. Отстоявшийся слой хлористого метилена (нижняя фаза) фильтруют в колбу с ранее полученным экстрактом.

Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40°С, подвергают очистке в соответствии с п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта

Сухой остаток в колбе, полученный по п. 9.1, растворяют в 2 см³ этилацетата, помещают на 30с в ультразвуковую баню. Затем в колбу добавляют 2 см³ гексана, смесь тщательно перемешивают и вносят на концентрирующий патрон Sep-Pak Plus Silica, подготовленный по п. 7.7. Колбу обмывают 5 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) и также вносят на патрон. Патрон дополнительно промывают 15 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), 20 см³ смеси этих же растворителей в объемном соотношении 3:7, затем 20 см³ этилацетата. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1-2 капли в сек. Элюат отбрасывают.

Изопропилфенацин элюируют с патрона 20 см³ 2% уксусной кислоты в этилацетате (п. 7.6), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35°С. Остаток в колбе растворяют в 2 см³ подвижной фазы (приготовленной по п. 7.2) и анализируют содержание изопропилфенацина по п. 9.3.

9.3. Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостной хроматограф «Breeze» с ультрафиолетовым детектором (фирма Waters, США).

Хроматографическая колонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry® С18, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода-орто-фосфорная кислота (89:11:0,1, по объему).

Скорость потока элюента: 1,0 см³/мин.

Рабочая длина волны: 312 нм.

Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 мм³.

Ориентировочное время выхода изопропилфенацина:

- орто-изомер: 7,72-8,01 мин

- пара-изомер: 9,14-9,45 мин.

Линейный диапазон детектирования: 1-20 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор изопропилфенацина с концентрацией 1 мкг/см³, разбавляют (не более чем в 50 раз) подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.2).

10. Обработка результатов анализа

Содержание изопропилфенацина в пробе рассчитывают по формуле:

где Х - содержание изопропилфенацина в пробе, мг/дм³;

A - концентрация изопропилфенацина, найденная по градуировочному графику, в соответствии с величиной суммы площадей хроматографических пиков орто- и параизомеров, мкг/см³;

W - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

V - объем анализируемого образца воды, см³.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

                                                                                                  (1)

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/дм³;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r=2,8 σ_r. При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 мг/дм³ при вероятности Р=0,95, где

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/дм³;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/дм³;

где δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее 0,0002 мг/дм³»*

__________________

*0,0002 мг/дм³ - предел обнаружения.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецинзионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

где  - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/дм³, при этом:

D_л = ± 0,84D,

где D - граница абсолютной погрешности, мг/дм³;

где δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где  - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/дм³.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле

,

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|К_к| ≤ К,                                                                                                                   (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)

                                                                                            (3)

где X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/дм³;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.