МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ

Микробиологические методы определения наличия антибиотиков

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности Россельхозакадемии (ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии) и Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 февраля 2010 г. № 25-ст

4 ВЗАМЕН ГОСТ Р 51600-2000

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

Содержание

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Дата введения - 2011-01-01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на сырое, пастеризованное, стерилизованное и предварительно восстановленное сухое коровье молоко (далее - молоко) и устанавливает качественные микробиологические методы определения наличия антибиотиков:

- чашечный метод с Bacillus stearothermophilus,

- метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурпур,

- метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бриллиантовый черный.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р 53430-2009 Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 975-88 Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2493-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия

ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9285-78 Калия гидрат окиси технический. Технические условия

ГОСТ 13805-76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 19881-74 Анализаторы потенциометрические для контроля рН молока и молочных продуктов. Общие технические условия

ГОСТ 22649-83 Стерилизаторы воздушные медицинские. Общие технические условия

ГОСТ 23454-79 Молоко. Методы определения ингибирующих веществ

ГОСТ 24065-80 Молоко. Методы определения соды

ГОСТ 24066-80 Молоко. Методы определения аммиака

ГОСТ 24067-80 Молоко. Метод определения перекиси водорода

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Оборудование, средства измерений, посуда, материалы и реактивы

3.1 Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ± 0,0002 г.

3.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317, поддерживающий температуру от 0 °С до 12 °С.

3.3 Центрифуга с частотой вращения 3000 мин^-1 и разделяющим фактором 750 м/с².

3.4 Пробирки центрифужные термостойкие вместимостью 25 см³ по ГОСТ 1770.

3.5 Термостат или блок термостатированных ячеек, поддерживающий температуру от 30 °С до 70 °С с допустимой погрешностью ± 0,5 °С.

3.6 Баня водяная с терморегулятором, поддерживающая температуру от 60 °С до 90 °С.

3.7 Анализатор потенциометрический по ГОСТ 19881 2-го класса точности с диапазоном измерения от 5,5 до 8,0 единиц рН.

3.8 Сепаратор-сливкоотделитель.

3.9 Шкаф сушильный, поддерживающий температуру (160 ± 5) °С.

3.10 Автоклав, поддерживающий температуру (121 ± 2) °С.

3.11 Стерилизатор воздушный медицинский по ГОСТ 22649 или стерилизатор паровой медицинский, поддерживающий температуру (121 ± 2) °С.

3.12 Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.

3.13 Микроскоп световой биологический.

3.14 Пробойник диаметром 10 мм или сверло пробочное № 4.

3.15 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

3.16 Линейка по ГОСТ 427 с пределом измерения 150 мм.

3.17 Аппарат «Микрофот 5ПО-1» или другой проекционный аппарат.

3.18 Колбы конические по ГОСТ 25336, вместимостью 25, 100, 250 см³.

3.19 Колбы мерные по ГОСТ 1770, вместимостью 200 и 1000 см³.

3.20 Пробирки по ГОСТ 1770, вместимостью 10 см³.

3.21 Чашка Петри по ГОСТ 25336.

3.22 Пипетки градуированные 2-го класса точности по ГОСТ 29227, вместимостью 5,10 и 25 см³.

3.23 Пипетки, отмеряющие объем 0,05 и 0,1 см³.

3.24 Шприц-дозатор автоматический вместимостью 0,1 см³ или шприц-дозатор автоматический вместимостью 1,0 см³, настроенный на объем пробы 0,1 см³.

3.25 Наконечники пластмассовые одноразовые, вместимостью 0,1 см³.

3.26 Пинцет.

3.27 Гидролизат кормовых дрожжей.

3.28 Эталон стандартный мутности по [1].

3.29 Препарат сухой для контроля определения ингибирующих веществ в молоке (СКИВ) по [2].

3.30 Образец стандартный стрептомицина по [3].

3.31 Фуксин основной по [4], спиртовой раствор концентрации 0,05 г/см³.

3.32 Экстракт дрожжевой по [5].

3.33 Глюкоза по ГОСТ 975.

3.34 Пептон сухой ферментированный для бактериологических целей по ГОСТ 13805.

3.35 Агар микробиологический по ГОСТ 17206.

3.36 Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

3.37 Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198.

3.38 Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493.

3.39 Калия гидрат окиси по ГОСТ 9285, раствор с массовой концентрацией 0,056 г/см³.

3.40 Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор с массовой концентрацией 0,0365 г/см³.

3.41 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

3.42 Тест-культура № 1 (тест-культура Bacillus stearothermophilus BKMB-510)¹⁾ - тест-культура Bacillus stearothermophilus.

3.43 Среда № 1 (среда агаровая питательная таблетированная «Delvotest^® SP»)²⁾ - питательком, капсулой силикагеля и поролоновым уплотнителем.

3.44 Среда № 2 (агаровая среда «Delvotest^® SP»)³⁾ - агаровая среда, содержащая споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур, герметично укупоренная в ампулы вместимостью 1,0 см³, собранные в блоки.

3.45 Среда № 3 (среда «Delvotest^® SP-NT» или «Delvotest^® SP MINI-NT»)⁴⁾ - смесь агаровой и питательной сред, содержащая споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бром-крезолпурпур, герметично укупоренная в ампулы вместимостью 1,0 см³, собранные в блоки.

3.46 Тест-набор № 1 (тест-набор «BRT Inhibitor Test»)⁵⁾, включающий: герметично укупоренные пробирки или пластины с агаровой и питательной средой, содержащей споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бриллиантовый черный; самоклеящуюся ленту для пластин; контрольный раствор молока с пенициллином G массовой концентрацией 0,004 мкг/г и контрольный раствор молока без антибиотиков.

Применение конкретных видов оборудования, средств измерений, материалов и реактивов осуществляется в соответствии с требованиями разделов 4 и 5.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

¹⁾ Тест-культура Bacillus stearothermophilus BKMB-510, выпускаемая Институтом биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН.

²⁾ Среда является рекомендуемой к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанной среды. Допускаются к использованию среды производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендована питательная среда «Delvotest® SP» (OOO «ДСМ Восточная Европа»).

³⁾ Среда является рекомендуемой к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанной среды. Допускаются к использованию среды производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендована агаровая среда «Delvotesl® SP» (OOO «ДСМ Восточная Европа»).

⁴⁾ Среда является рекомендуемой к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанной среды. Допускаются к использованию среды производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендованы среды «Delvotest^® SP-NT» и «Delvotest^® SP MINI-NT» (OOO «ДСМ Восточная Европа»)

⁵⁾ Тест-набор является рекомендуемым к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанного тест-набора. Допускаются к использованию тест-наборы производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендован тест-набор «BRT Inhibitor Test» (OOO «Xp. Хансен»).

4 Отбор и подготовка проб

Отбор проб и подготовка проб - по ГОСТ Р 53430 с дополнением. Допускается хранить подготовленные пробы молока в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С не более 24 ч.

5 Методы контроля

5.1 Чашечный метод с Bacillus stearothermophilus

Метод основан на способности антибиотиков, содержащихся в молоке, диффундировать в агаровую среду со спорами Bacillus stearothermophilus и препятствовать их росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Наличие антибиотиков в молоке устанавливают по размеру диаметра зоны ингибиции.

5.1.1 Подготовка к определению

5.1.1.1 Подготовка лабораторной посуды - по ГОСТ Р 51446.

5.1.1.2 Приготовление сред

Питательная среда: в мерной колбе по ГОСТ 1770 вместимостью 1000 см³ в небольшом количестве дистиллированной воды по ГОСТ 6709 растворяют 10,0 г дрожжевого экстракта по 3.32, 20,0 г пептона по ГОСТ 13805, 0,5 г глюкозы по ГОСТ 975, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки и потенциометрическим анализатором по 3.7 устанавливают активность питательной среды (7,1 ± 0,1) единиц рН. Затем в необходимое количество конических колб по ГОСТ 25336 вместимостью 250 см³ наливают по 200 см³ приготовленной питательной среды и стерилизуют в стерилизаторе по 3.11 при температуре (121 ± 2) °С в течение (15 ± 1) мин.

Срок хранения питательной среды в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С - 1 мес.

Агаровая среда: в мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 200 см³ вносят 100 см³ дистиллированной воды, 1,0 ггидролизата кормовых дрожжей, 0,4 г пептона, 0,1 г хлористого натрия по ГОСТ 4233 и 1,6 г микробиологического агара по ГОСТ 17206, перемешивают до полного растворения и нагревают на электроплитке до кипения. Затем агаровую среду охлаждают до температуры (55 ± 5) °С, устанавливают активность агаровой среды (7,3 ± 0,1) единиц рН и стерилизуют при температуре (121 ± 2) °С в течение (15 ± 1) мин.

Срок хранения агаровой среды в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С - 1 мес.

Допускается применять среды промышленного изготовления, аналогичные указанным выше.

5.1.1.3 Получение спор тест-культуры

Питательную среду, подготовленную по 5.1.1.2, засеивают 2 - 3 см³ тест-культуры № 1 по 3.42, выращенной в пробирках с этой же средой в течение 18 - 20 ч, тщательно перемешивают, помещают в термостат и нагревают при температуре (55 ± 1) °С в течение 3 сут.

После окончания инкубации из посевов берут мазки, окрашивают их спиртовым раствором основного фуксина по 3.31 с массовой концентрацией 50 г/дм³ и микроскопируют. При наличии в колбах с посевами 90 % - 95 % свободных сформировавшихся спор колбы помещают в холодильник на 16 - 18 ч для осаждения спор. Образовавшуюся надосадочную жидкость из колб сливают, а оставшийся осадок распределяют по стерильным центрифужным пробиркам и прогревают на водяной бане при температуре (67 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин. После этого пробирки помещают на центрифугу по 3.3 и центрифугируют 20 - 30 мин. Полученный осадок в каждой пробирке промывают дистиллированной водой (не менее трех раз) до получения прозрачной жидкости над ним.

Взвесь спор повторно нагревают при температуре (67 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин и переносят в пробирки.

Срок хранения спор тест-культур в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С - не более 2 мес.

5.1.1.4 Приготовление засеянной агаровой среды

В пробирки отбирают взвесь спор тест-культуры, подготовленной по 5.1.1.3, и разводят дистиллированной водой до получения суспензии спор, визуально соответствующей 10 единицам по стандартному эталону мутности по [1].

К 100 см³ расплавленной и охлажденной до (60 ± 2)°С агаровой среды, подготовленной по 5.1.1.2, добавляют 2,5 см³ 40 %-ного водного раствора глюкозы и 4 см³ суспензии спор, подготовленной как указано выше. Смесь агаровой среды и суспензии спор тщательно перемешивают и градуированной пипеткой разливают по (11 ± 1) см³ в подготовленные для определения чашки Петри по ГОСТ 25336, установленные на горизонтальной поверхности.

Чашки Петри с засеянной смесью агаровой среды и суспензии спор допускается хранить в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С не более 2 сут. Перед проведением определения чашки Петри прогревают в термостате при температуре (55 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин.

5.1.1.5 Подготовка проб и приготовление обезжиренного стерильного молока

а) Подготовка проб

Определению на наличие антибиотиков подлежат пробы молока, давшие положительный результат по ГОСТ 23454 и отрицательный - по ГОСТ 24065, ГОСТ 24066, ГОСТ 24067. В стерильные пробирки пипеткой по ГОСТ 29227 отбирают по 5 - 10 см³ анализируемой пробы молока, нагревают на водяной бане при температуре (87 ± 2) °С в течение (10 ± 1) мин и охлаждают в холодной воде до температуры 18 °С - 25 °С.

б) Приготовление обезжиренного стерильного молока

Обезжиренное стерильное молоко получают из молока, предварительно проверенного на отсутствие ингибирующих веществ по ГОСТ 23454, с кислотностью 16 - 18 °Т при помощи сепаратора-сливкоотделителя. Обезжиренное молоко разливают в пробирки по 10 см³ и стерилизуют при 101 кПа (1 атм.) в течение (10 ± 1) мин.

5.1.1.6 Приготовление контрольного раствора стрептомицина

Контрольный раствор стрептомицина используют для проверки активности роста спор тест-культуры.

а) Приготовление фосфатных буферных растворов 1 и 2

Раствор 1: в мерной колбе вместимостью 1000 см³ в небольшом количестве дистиллированной воды растворяют 2,0 г двузамещенного фосфорнокислого калия по ГОСТ 2493 и 8,0 г однозамещенного фосфорнокислого калия по ГОСТ 4198 и доводят объем дистиллированной водой до метки. Устанавливают рН раствора (6,1 ± 0,1)с помощью растворов гидрата окиси калия по 3.39 или соляной кислоты по 3.40.

Раствор 2: в мерной колбе вместимостью 1000 см³ в небольшом количестве дистиллированной воды растворяют 16,73 г двузамещенного фосфорнокислого калия и 0,523 г однозамещенного фосфорнокислого калия и доводят объем дистиллированной водой до метки. Устанавливают рН раствора (7,9 ± 0,1) с помощью растворов гидрата окиси калия или соляной кислоты.

Растворы стерилизуют при температуре (112 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин.

Срок хранения растворов в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С - не более 30 сут.

б) Приготовление основного раствора стрептомицина с массовой концентрацией 500 мкг/см³

(5 ± 1) мг стрептомицина по [3] растворяют в конической колбе вместимостью 25 см³ в фосфатном буферном растворе 1. Соотношение фактического значения массовой концентрации стрептомицина к объему буферного раствора 1 должно быть 1:100.

Пример - При массовой концентрации стандарта стрептомицина 760 мкг/см³ 5 мг антибиотика (5 мг) растворяют в 7,6 см³ буферного раствора 1, получив основной раствор с массовой концентрацией 500 мкг/см³.

Срок хранения основного раствора стрептомицина в посуде из темного стекла с притертой пробкой при температуре (5 ± 1) °С - не более 30 сут.

в) Приготовление контрольного раствора стрептомицина с массовой концентрацией 2,5 мкг/см³ Подготавливают три стерильных пробирки вместимостью 10 см³. В первую пробирку наливают

1 см³ фосфатного буферного раствора 2 и 1 см³ основного раствора стрептомицина, во вторую - 9 см³ фосфатного буферного раствора 2 и 1 см³ раствора из первой пробирки, в третью - 9 см³ стерильного обезжиренного молока по 5.1.1.5 б) и 1 см³ раствора из второй пробирки.

Массовая концентрация стрептомицина в разведениях составляет соответственно 250; 25 и 2,5 мкг/см³. Третье разведение с массовой концентрацией 2,5 мкг/см³ является контрольным раствором.

Срок хранения контрольного раствора стрептомицина - не более 12 ч.

Допускается вместо контрольного раствора стрептомицина использовать предварительно восстановленный по ГОСТ 23454 (аналогично) препарат СКИВ по [2].

5.1.2 Проведение определения

5.1.2.1 На поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри по 5.1.1.4, пробойником по 3.14 или пробочным сверлом вырезают семь лунок диаметром 10 мм (см. рисунок 1). Шесть лунок располагают по окружности чашки на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 28 мм их центров от центра чашки. Седьмую лунку вырезают в центре чашки в случае использования контрольного раствора стрептомицина.

5.1.2.2 В шесть лунок, расположенных по окружности чашки, пипеткой по 3.23 вносят по 0,05 см³ анализируемого молока, подготовленного по 5.1.1.5 а). В центральную лунку вносят 0,05 см³ контрольного раствора стрептомицина.

Рисунок 1 - Схема расположения лунок

5.1.2.3 Чашки Петри выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин, затем их помещают в термостат крышками вверх и инкубируют при температуре (55 ± 1) °С в течение 4 ч. Чашки в термостате размещают в один ряд.

5.1.3 Обработка результатов

5.1.3.1 Результаты определения оценивают непосредственно после инкубирования по 5.1.2.3, просматривая чашки Петри в проходящем свете от любого источника света.

Диаметры зон ингибиции роста тест-культуры, образуемых при взаимодействии с антибиотиками в пробах анализируемого молока и контрольным раствором стрептомицина, измеряют линейкой или на аппарате «Микрофот 5ПО-1» по краям окружностей зон.

5.1.3.2 При отсутствии зон ингибиции контрольного раствора стрептомицина (центральная лунка) определение повторяют.

5.1.3.3 Зона ингибиции диаметром 12 мм и более свидетельствует о присутствии антибиотиков в анализируемой пробе молока.

Зона ингибиции диаметром не более 12 мм или ее отсутствие свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемой пробе.

(Поправка. ИУС 12-2010 г.)

5.2 Метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурпур

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bacillus stearothermophilus various calidolactis C953 от фиолетовой до желтой - при отсутствии в анализируемом молоке антибиотиков и сохранении фиолетовой окраски - при наличии антибиотиков.

5.2.1 Подготовка к определению

5.2.1.1 Подготовка бутылочек со средой № 1

Стеклянную бутылочку со средой № 1 по 3.43 вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20 мин при температуре (20 ± 5) °С.

Открывают бутылочку, колпачок помещают на стол вниз донышком.

Пинцетом вынимают капсулу с силикагелем и поролоновый уплотнитель. Насыпают в колпачок необходимое количество таблеток питательной среды. Поролоновый уплотнитель и капсулу с силикагелем помещают в бутылочку.

5.2.1.2 Подготовка ампул со средами № 2 и № 3

Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают необходимое число ампул от блока со средой № 2 по 3.44 или средой № 3 по 3.45 и маркируют их. Оставшиеся ампулы в упаковке хранят в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С.

Соединительной частью шприца-дозатора по 3.24 прокалывают укупорочный материал ампул со средами № 2 или № 3. В каждую открытую ампулу со средой № 2 пинцетом помещают по одной таблетке среды № 1 по 5.2.1.1. Затем бутылочку с таблетированной питательной средой по 5.2.1.1 плотно закрывают колпачком и хранят при температуре (20 ± 2) °С.

5.2.2 Проведение определения

5.2.2.1 В каждую ампулу по 5.2.1.2 шприцем-дозатором вносят 0,1 см³ анализируемого молока, используя каждый раз новый наконечник. Оставшиеся анализируемые пробы хранят в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С до окончания определения.

Ампулы помещают в термостат и выдерживают при температуре (64,0 ± 0,5) °С в течение 3 ч.

5.2.2.2 Контрольное определение проводят в соответствии с 5.2.2.1. В ампулу вносят 0,1 см³ предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.

5.2.3 Обработка результатов

5.2.3.1 Ампулы извлекают из термостата и определяют цвет содержимого анализируемого молока.

5.2.3.2 Желтый цвет содержимого ампул с анализируемыми пробами молока свидетельствует об отсутствии в нем антибиотиков. Фиолетовое кольцо, образовавшееся на поверхности содержимого ампул (диаметром не более 1 мм), не учитывают.

5.2.3.3 Фиолетовый цвет содержимого ампул с контрольной пробой и анализируемыми пробами молока свидетельствует о наличии антибиотиков.

5.3 Метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бриллиантовый черный

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bacillus stearothermophilus various calidolactis от синей до желтой при отсутствии в испытуемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении синей окраски - при наличии антибиотиков.

5.3.1 Подготовка к определению

Отрезают необходимое число полосок от тестовых пластин тест-набора № 1 по 3.46 или берут требуемое количество пластин или пробирок тест-набора № 1. Удаляют запаянную фольгу с тестовых полосок и пластин или откупоривают пробирки. Оставшиеся пластины или пробирки хранят в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С.

5.3.2 Проведение определения

5.3.2.1 При использовании пластин или полосок в одну из ячеек каждой пластины или полоски одноразовой пипеткой вносят 0,1 см³ контрольного раствора молока без антибиотиков по 3.46, в другую ячейку - 0,1 см³ контрольного раствора молока с пенициллином G, в остальные ячейки пластины или полоски вносят по 0,1 см³ анализируемого молока в двукратной повторности.

5.3.2.2 При использовании пробирок в одну пробирку одноразовой пипеткой вносят 0,1 см³ контрольного раствора молока без антибиотиков, в другую - 0,1 см³ контрольного раствора молока с пенициллином G, в остальные пробирки одноразовой пипеткой вносят по 0,1 см³ анализируемого молока в двукратной повторности.

5.3.2.3 Тестовые пластины и полоски заклеивают самоклеящейся лентой по 3.46, пробирки закупоривают и помещают в блок термостатированных ячеек по 3.5 или на водяную баню по 3.6 при температуре (65,0 ± 0,5) °С и выдерживают до тех пор, пока содержимое на дне ячейки тестовых пластин или полосок, или пробирки с контрольным раствором молока без антибиотиков не окрасится полностью в желтый цвет в течение (135 ± 15) мин.

5.3.3 Обработка результатов

5.3.3.1 Пробирки, тестовые пластины или тестовые полоски извлекают из блока термостатируемых ячеек или водяной бани и определяют цвет содержимого на дне, не нарушая их целостности.

5.3.3.2 Желтый цвет содержимого пробирок или ячеек тестовых полосок или пластин с контрольным раствором и анализируемыми пробами молока свидетельствует об отсутствии в нем антибиотиков.

5.3.3.3. Синий цвет содержимого пробирок или ячеек тестовых полосок или пластин с контрольным раствором и анализируемыми пробами молока свидетельствует о наличии в нем антибиотиков.

6 Метрологические характеристики

Наименьшие пределы определения антибиотиков в молоке приведены в таблице 1.

Таблица 1

Ед/г (мкг/г)*

7 Требования безопасности

При работе с химическими реактивами следует соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005 и ГОСТ 12.1.007.

Работу со споровой тест-культурой в лаборатории проводят в соответствии с санитарными правилами по [6].

Библиография

Ключевые слова: молоко и молочные продукты, чашечный метод с Bacillus stearothermophilus, метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурпур, метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бриллиантовый черный, метрологические характеристики, требования безопасности